ЗАТВЕРДЖУЮ:заступник директора ІП УААНз наукової роботи _________ к.б.н. Терещенко О.В. “____”__________________2006 р. |
РОБОЧА ПРОГРАМАна 2006 – 2010 роки. з виконання завдання 02.03. Розробити метод одержання моноклональних антитіл на основі використання клітинної лінії курей на 2006 рік 02.03.01. Удосконалити метод трансформації лімфоїдних клітин кісткового мозку добових курчат на 2007 рік. 02.03.02. „Визначити взаємозв’язок типу середовища та його компонентів з проліферацією трансформованих лімфоїдних клітин” 1. Стан вивчення завдання з урахуванням аналізу останніх досягнень науки і техніки в Україні та за її межами. У птахівництві необхідно проводити велику кількість аналізів для визначення імунологічного та серологічного статусу промислових стад птиці. Для цього використовують різноманітні тест-набори, які виготовляють на основі антисироваток. В сучасній біології все більш вагоме місце займає біотехнологія. Застосування біотехнологічних розробок дозволить створити набори на основі моноклональных антитіл для проведення імунологічного аналізу, які характеризуються високою чутливістю. Використання для створення таких наборів антитіл забезпечить більшу точність якісного та кількісного аналізу. Для промислових цілей вони необхідні у великій кількості. Отримання антитіл традиційними методами ускладнюється специфічністю імунної відповіді, а їх титр, як і перехресні реакції, варіюють від тварини до тварини і від однієї партії сироватки до іншої. Це визначається тим, що даний антиген викликає утворення цілого набору антитіл [2]. Це поставило задачу налагодити виробництво антитіл однієї специфічності (моноклональных) в промисловому масштабі. Запропоновані раніше методи виробництва антитіл мали цілий ряд недоліків і не задовольняли поставлених вимог. Неможливо було отримати промислові кількості моноклональных антитіл на необхідні антигени, а поліклональні антисироватки мали перехресну реактивність і містили малу кількість моноклональных антитіл. У зв’язку з цим революційним досягненням послужила розробка методики отримання лімфоїдних гібридом, яка дозволила отримати моноклональні антитіла практично на будь-який антиген в необхідних кількостях [17]. Лімфоїдні гібридоми – це “безсмертні” клітинні клони, які продукують моноклональні антитіла заданої специфічності. Гібридоми отримують шляхом злиття трансформованих клітин та “нормальних” лімфоцитів. Існують гібридоми на основі клітин миші, пацюка, китайського та золотистого ховраха, людини. На даний момент існує близько 50 тисяч гібридом, які синтезують різноманітні типи моноклональных антитіл [3, 7]. Дана методика є лідером по комерційному оберту продуктів біотехнології у світі. На теперішній час перспективним є отримання гібридом на основі ліній клітин курей, що диктується видовою специфічністю дії моноклональных антитіл. Клітини курей мають ряд генетичних та фізіологічних особливостей, що визначає перспективу отримання гібридом на їх основі [8, 16]. Дослідження по отриманню моноклональных антитіл, які продукуються на основі лінії лімфоїдних клітин курей, поділяється на ряд етапів:
Для отримання лімфоїдних гібридом потрібно, в першу чергу, одержати лінію клітин, необхідну для отримання гібридоми зі здатністю до необмеженої проліферації [7, 17]. Для отримання лінії клітин слід провести трансформацію “нормальних” клітин у ракові. Подібна трансформація приводить до здатності “нормальних” клітин до необмеженої проліферації, що є характерним для ракових клітин. Трансформація – це термін, який характеризує зміну ростових властивостей культивуючих клітин. Зміна ростових властивостей, є одною із адаптивних особливостей, яка дозволяє клітинам проліферувати в умовах, несприятливих для нетрансформованих клітин [1]. Трансформацію клітин можна проводити за допомогою різних речовин, вибір яких залежить від умов експерименту та вимог до клітинної лінії. До таких трансформуючих реагентів можуть відноситись різноманітні віруси, які сприяють розвитку пухлин, різні типи опромінювання, мутагени, що мають канцерогенну активність, та інші. Більша перевага надається вірусам, оскільки вони, на відміну від інших вище перерахованих факторів, найбільш точно впливають на клітини [6, 14]. Під час отримання клітинної лінії лімфоїдних клітин курей з метою послідуючого отримання гібридом на їх основі буде використано мутагени, що мають канцерогенну дію (метилнітрозосечовина). Віруси в даному випадку не підходять з ряду причин, однією з яких є активація “сплячих вірусів” при злитті клітин в процесі отримання лімфоїдних гібридом, що може привести до забруднення середовища вірусними частками і до лізису клітин [13]. У зв’язку з цим в якості трансформуючого агента було вибрано метилнітрозосечовину, яка має досить сильний мутагенний ефект, але для неї не характерні вище перераховані недоліки, властиві опухолетворним вірусам. Метилнітрозосечовина викликає випадкові зміни в складі ДНК досліджуваних клітин. Характер і кількість змін залежать як від досліджуваного об'єкта, так і від концентрацій мутагену й умов проведення трансформації. При мутації генів, відповідальних за контроль розподілу клітин, відбувається трансформація клітини, що приводить до появи здатності до необмеженої проліферації в культурі при відповідних умовах культивування, а також до зміни часу подвоєння клітин (як правило, до його зменшення). Ці якості, що з’являються у клітин після трансформації, є необхідною умовою для наступного одержання лімфоїдних гібридом. Для створення лінії лімфоїдних клітин добових курчат необхідно не лише провести трансформацію клітин, але також розробити середовище для їх довготривалого культивування. Методики культивування, які підходять для “нормальних” (не трансформованих) клітин, у випадку з трансформованими можуть не підійти. Кількість поділів трансформованих клітин в культурі необмежена (що вказує на проходження трансформації) на відміну від “нормальних” клітин, що приводить до необхідності розробки методики для тривалого культивування. Метою трансформації є одержання лінії клітин здатних до нескінченної проліферації в умовах культивування. Згідно з клонально-селективною теорією (Burnet F.M.) клоном лімфоїдних клітин слід вважати популяцію клітин, продуцируючих один тип антитіл (моноклональний). Лімфоїдні клітини кісного мозку, які не пройшли остаточної диференціровки, не синтезують повноцінний імуноглобулін на відміну від «зрілих» лімфоцитів. Тому можна сказати про порівняно гомогенну популяцію клітин, одержаних із суспензії кісного мозку добових курчат. Т.я. метою трансформації, в даній роботі, є одержання лінії клітин (здатних до нескінченої проліферації) для подальшого одержання лімфоїдних гібридом, то відпадає необхідність одержання нащадків суворо однієї клітини. 2. Програма досліджень Метою цього проекту є отримання лінії лімфоїдних клітин курей і гібридом на їх основі, які продукують моноклональні антитіла заданої специфічності. Будуть вивчені лінії лімфоїдних клітин та їх можливості для подальшого використання в якості “клітин-носіїв” для потреб біотехнології. Також будуть досліджені гібридоми, отримані шляхом злиття трансформованих лімфоїдних клітин курей і лімфоцитів, які синтезують моноклональні антитіла на заданий антиген. Для досягнення поставленої мети дослідження будуть розділені на слідуючі етапи:
ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ
|