ЗАТВЕРДЖУЮ:

РОБОЧА ПРОГРАМА

1. Стан вивчення завдання з урахуванням аналізу останніх досягнень науки і техніки в Україні та за її межами.

Україна бере активну участь у міжнародному співробітництві з охорони біологічного різноманіття, збереження видів тварин, у тому числі і птахів, шляхом створення банків їхнього генофонду, організації біосферних заповідників, заказників та інших заповідних об’єктів, здійснення інших заходів.

Незважаючи на заходи, які приймаються, продовжується процес скорочення і навіть зникнення ряду рідкісних популяцій птахів. Разом з тим, деякі з них є джерелом генів, що можуть знадобитись у подальшому генетикам та селекціонерам. Зникнення одного чи кількох диких видів птахів у конкретному регіоні може призвести до самих несподіваних наслідків, у тому числі екологічного характеру. На теперішній час немає єдиної технології, що дозволить збереження генофонду птахів у повному обсязі. Існуючі технології крiоконсервації сперми різноманітних видів с/г птахів дають можливість збереження тільки батьківських геномів. Тому, у сучасних умовах зростаючого ввозу продукції закордонних птахівницьких фірм, внаслідок якого місцеві породи витісняються із споживчого обігу, та нестаток фінансових коштів для проведення широкомасштабних заходів по розведенню та збереженню рідких та зникаючих видів птахів, розробка ефективної технології збереження генофонду птахів є для України особливо актуальною. Тому метою цього проекту є розробка технологіі збереження генотипів рідкісних і зникаючих популяцій птахів та їх використання для відтворення особин із запланованими генетичними параметрами. Розробка технології передбачає відтворення збережених геномів у першому поколінні нащадків химерних особин.

Наукові досягнення в області ембріології, молекулярної біології, генної та клітинної інженерії дозволяють з нових позицій розглянути питання відтворення та збереження сільськогосподарської птиці.

В свою чергу, одним з методів отримання такої птиці є трансплантація ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) та первинних статевих клітин (ПСК) як стовбурової лінії для гамет при виробництві проміжних химерних індивідуумів, зокрема химер по лінії гоноцитів донора – гермінативних химер. Підвищення здатності ПСК колонізувати гонади реципієнта вирішується шляхом послаблення його власної лінії цих клітин при трансплантації їх суспензії у сприймаючий ембріон-мішень. Заморожування ПСК із наступним їх розмороженням та ін’єкцією в ембрiон-реципiєнт з метою одержання химер по лінії статевих клітин дозволить досягнути збереження генотипів рідкісних і зникаючих популяцій птахів протягом декількох десятиріч та їх використання для відтворення особин із запланованими генетичними параметрами.

Первинні статеві клітини (ПСК) курей спочатку виявляють в центральній області бластодерми на стадії Х (по EyalGiladi) [5] за допомогою йодної кислоти - Шифф забарвлювання або імунозабарвленням із використанням моноклональних антитіл SSEA-1 та ЕМА-1 [6]. Застосовують різні підходи для реалізації потенціалу донорських ПСК через химерні організми як в плані отримання трансгенів, так і для розробки біотехнологічного методу збереження генофонду птахів. Для цього ПСК виділялися із зони зародкового півмісяця [10], з ембріональної крові [9] або з ембріональних гонад [3]. Однак, ефективність включення донорських ПСК в лінію статевих клітин ембріонів-реципієнтів дуже низька. Способи концентрування ПСК та часткової елімінації ПСК ембріонів-реципієнтів дозволяють значно підвищити ефективність методу.

З’являючись в бластодермі курячого зародка, ПСК на ранніх стадіях ембріонального розвитку через кровоносне русло переходять до місця локалізації гонад для їх заселення. Згідно літературних даних ПСК, виділені з бластодерми та гонад, мають здатність прикріплення до підложки культивування. На цих стадіях розвитку хоча і розроблено методи виявлення та виділення ПСК із загальної популяції клітин, ефективність їх застосування часто підлягає сумнівам. Невідомо, чи зберігається здатність прикріплення ПСК до підложки в період їх циркуляції в крові. Якщо припустити, що ПСК не втрачають цю здатність за цей час, а клітини крові не здатні прикріпитись до підложки, то такі умови можна використати для чистого виділення і концентрування ПСК.

Консервування генетичного матеріалу курей здійснювали у вигляді суспензії тотіпотентних ембріональних клітин, які були виділені з бластодерми курей або популяції ПСК, виділеної з крові ембріонів на 14-15 стадії розвитку по Гамбургеру та Гамільтону [7]. В ІП УААН в 1993 році було розроблено метод кріоконсервування суспензії бластодермальних клітин курей з використанням в якості кріопротектору ДМСО та швидкості охолодження 1°С/хв, який дозволяє отримати 80 – 90% цілих клітин після деконсервування [3]. Незважаючи на те, що цитоморфологічний тест збереженості клітин після заморожування та відтавання показує високий результат, при наступному використанні таких клітин для отримання химер спостерігається значне зниження відсотку химеризму по лінії статевих клітин (0-20%) [8]. Низький відсоток химеризму після ін’єкції заморожено-відтанувших клітин, можливо, пов’язаний з тим, що критерієм ефективності способу заморожування береться цілісність загальної популяції клітин, а не конкретно ПСК, кількість яких в бластодермі не перевищує 30-35 штук. Крім того, після розміщення в культурі кількість бластодермальних клітин, які були заморожені за методом 1993 року, які прикріпились до підложки склало всього 40 –50%. Це послужило причиною проведення у 2001 році в ІП УААН робіт по удосконаленню методу заморожування [2]. Застосування нового кріопротектору 1,2-пропандіолу, та заходів по зниженню переохолодження при кристалізації дозволили збільшити кількість бластодермальних клітин, які зберегли життєздатність по культуральному тесту до 60 –70%.

2. Програма досліджень

Метою цього проекту є розробка технології збереження генотипів рідкісних і зникаючих популяцій птахів протягом декількох десятиріч та їх використання для відтворення особин із запланованими генетичними параметрами. Розробка технології передбачає відтворення збережених геномів у першому поколінні нащадків химерних особин.

Для досягнення поставленої мети дослідження будуть розділені на слідуючі етапи:

1. 2006р. Розробити метод виділення первинно-статевих клітин з крові і ембріональних гонад, вивчити морфологічні та культуральні властивості.
2. 2007р. Визначити здатність вбудовування культивованих первинних зародкових клітин в гонади ембріона-реципієнта
3. 2008р. Розробити метод кріоконсервування первинно-статевих клітин.
4. 2009р. Розробити ефективні прийоми підготовки ембріонів-реципієнтів до ін’єкцій заморожено-відтаяних ПСК.
5. 2010р. Відновити первинні породи з деконсервованих ПСК.

ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ

1. Лилли Р. Патогістологічна техніка та практична гістохімія. М. Мир. 1969.-645 с.
2. Тагиров М.Т., Артеменко А.Б., Кальченко Ю.В. Підвищення ефективності метода кріоконсервування бластодермальних клітин ембріонів курей // Птахівництво: Мiжвiд. темат. наук. зб.(за матеріалами III Украiнської конф. по птахівництву з міжнародною участю) / IП УААН. - Борки, - 2001, - Вiп.51. - С.175-179.
3. Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Тагиров М.Т., Белецкая А.В., Сахацкий Н.И. Низькотемпературна консервація бластодермальних клітин ембріонів курей // С.-х. біологія. - 1993. - N 6. - C. 53-58.
4. Chang I.K., Jeong D.K., Hong Y.H., Park T.S., Moon Y.K., Ohno T., Han J.Y. Production of germ-line chimeric chickens by transfer of cultutered primordial germ cells // Cell Biology International. – 1997. – V. 21. – P. 495-499.
5. Eyal-Giladi H., Ginsburg M., Farbarov A. Avian primordial germ cells are of epiblast origin // J. Embryol. Exp. Morphol. – 1981. – V. 65. – P. 139-147.
6. Karagenc L., Cinnamon Y., Ginsburg M., Petitte J.N. Origin of primordial germ cells in the prestreak chick embryo // Dev. Genet. – 1996. – P. 290-301.
7. Naito M., Tajima A., Tagami T., Yasuda Y., Kuwana T. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring // J. Reprod. Fertil. – 1994. – V. 102. – P. 321-325.
8. Petitte J.N., Brazolot C.L., Clarck M.E., Verrinder Gibbins A.M., Etches R.J. Accessing of genome of the chicken using germline chimeras // Manipulation of avian genome: Eds R.J.Etches and A.M.Verrinder Gibbins. – 1993, CRC Press, Boca Raton. – P. 81-101.
9. Simkiss K., Rowlett K., Bumstead N., Freeman B.M. Transfer of primordial germ cell DNA between embryos // Protoplasma. – 1989. – V. 151. – P. 164-166.
10. Wentworth B.C., Tsai H., Wentworth A., Wong E., Proudman J., El Halawani M. Primordial germ cells for genetic modification of poultry // Biotechnology’s role in the genetic improvement of farm animals [edited by Milleer R.H., Pursel V.G., Norman H.D.]. – Savoy, USA: American Society of Animal Science. – P. 202-227.
11. T.S. Park, D.K.Jeong, J.N. Kim, G.H.Song, Y.H.Hong, J.M.Lim, J.Y.Han. Improved Germline transmition in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos //Biology of reproduction. -2003. -V. 68. –P. 1657-1662.
12. N. Tsunekawa, M.Naito,Y.Sakai, T.Nishida, T. Noce. Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells. //Development .-2000. –V. 127 –P. 2741-2750.
13. M. Naito, A.Sano, T. Harumy, Y. Matsubara, T.Kuwana. Migration of primordial germ cells isolated from embryonic blood into the gonads after transfer to stage X blastoderms and detection of germline chimaerism by PCR. //British Poultry Science. -2004. -V.45. –N. 6. –P. 762-768.